【Neuron】高枕无忧！丹阳研究组揭示中脑促进NREM睡眠的神经环路机制

睡眠，是与觉醒交替出现的一种生理状态。睡眠并不是浪费时间，它能够帮助人们恢复体力、构建认知、调节消化等等，是人们赖以生存的必备生理需求。根据睡眠过程中脑电图表现、眼动情况和肌张力变化，睡眠可分为非快速眼动（NREM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠两种时相。NREM睡眠时期，机体处于休息状态，有助于消除疲劳、生长发育；REM 睡眠时期，机体肌肉松弛但脑神经元高度兴奋，有助于巩固记忆。      

图片来源：PenBay Pilot

研究表明，中脑腹外侧导水管周围灰质（vlPAG）参与REM睡眠的调控，杀死或抑制vlPAG神经元促进REM睡眠[1, 2]，此门控效应很可能由vlPAG GABA能神经元所介导，因为激活这群神经元显著减少REM睡眠时间[3]。

除GABA能神经元以外，vlPAG还包含大量谷氨酸能神经元。当机体面临危险时，这些神经元通过投射到延髓使机体产生不动行为（Behavioral immobility）[4]。不动，是睡眠的典型特征。那么，vlPAG是否有部分谷氨酸能神经元参与睡眠-觉醒节律的调控呢？

导水管周围灰质的各个亚区

图片来源：Trends in neurosciences [5]

 vlPAG谷氨酸能神经元除了释放谷氨酸之外，也会释放多种神经肽。其中，神经降压素（Neurotensin, NTS）可以降低血压和体温[6, 7]，这两个特点也是NREM睡眠的典型特征[8]。但是，有关神经降压素能神经元是否以及如何调节睡眠-觉醒节律，我们尚未可知。

NTS的受体及参与的各种功能

图片来源：Frontiers in Endocrinology [9]

2019年09月30日，《Neuron》杂志在线刊登了霍华德·休斯医学院丹阳研究组的最新重要工作[10]，他们发现vlPAG NTS阳性谷氨酸能神经元在NERM睡眠状态下被激活，这些神经元通过投射到延髓GABA能神经元以抑制多种促进觉醒的神经元，进而促进NERM睡眠。这项研究首次发现vlPAG谷氨酸能神经元调控睡眠-觉醒节律，并揭示其神经环路机制，极大提高了人们在睡眠领域的认知。

Yang Dan, PhD

图片来源：Howard Hughes Medical Institute

结果

1

vlPAG NTS神经元促进NREM睡眠

为探究vlPAG NTS神经元在睡眠-觉醒节律方面的功能，作者在NTS-Cre小鼠的vlPAG注射AAV-DIO-ChR2-eYFP或AAV-DIO-iC++并植入光纤，发现几乎所有vlPAG NTS神经元均为谷氨酸能神经元（图1A）。行为学方面，光激活vlPAG NTS神经元延长小鼠NREM睡眠时间，缩短REM睡眠与觉醒时间；而光抑制这些神经元缩短小鼠NREM睡眠时间，延长觉醒时间（图1B-C）。他们还在NTS-Cre小鼠的vlPAG注射AAV-DIO-hM3Dq或AAV-DIO-hM4Di以化学操控vlPAG NTS神经元，得到相似结果（图1D-E），表明vlPAG NTS神经元参与睡眠-觉醒状态的调控。

图1 vlPAG NTS神经元促进NREM睡眠

2

NREM睡眠激活大多数vlPAG NTS神经元

为检测睡眠-觉醒循环过程中vlPAG NTS神经元的活性变化，作者使用显微内窥镜钙成像技术，在NTS-Cre小鼠的vlPAG注射AAV-DIO-GCaMP6f并植入梯度折射率透镜（图2A），发现83.8% vlPAG NTS神经元在NREM睡眠过程中活性更高，只有1.4% vlPAG NTS神经元在觉醒过程中活性更高（图2B-D）。他们又使用光电极在体记录方法，得到相似结论（图2E-H），表明大多数vlPAG NTS神经元在NREM睡眠状态下被激活。

图2 NREM睡眠激活大多数vlPAG NTS神经元

3

vlPAG NTS神经元通过GiV介导NREM睡眠

过去研究表明，vlPAG谷氨酸能神经元-延髓环路介导小鼠的不动（immobility）行为[4]。vlPAG NTS神经元同样投射到延髓，尤其是腹侧巨细胞网状核（GiV；图3A）。为探究vlPAG NTS-CVM环路在睡眠-觉醒循环过程中的功能，作者在NTS-Cre小鼠的vlPAG注射AAV-DIO-ChR2，在GiV植入光纤，发现光激活vlPAG NTS-CVM环路增加小鼠NREM睡眠时间，减少REM睡眠与觉醒时间（图3B）。他们又在NTS-Cre小鼠的GiV注射逆行病毒rAAV2-retro-DIO-ChR2，在vlPAG植入光纤，得到相同结果（图3C-D），表明vlPAG NTS-GiV环路正向调控NREM睡眠状态。

图3 vlPAG NTS-GiV环路介导NREM睡眠

为进一步探究vlPAG NTS-GiV的功能性投射，作者使用狂犬病毒逆行示踪技术，在GAD2-Cre小鼠的GiV注射辅助AAV和RV，发现vlPAG神经元投射到GiV GABA能神经元，其中NTS神经元占比40.8%（图4A）。

然后，他们在NTS-Cre小鼠的vlPAG注射AAV-DIO-ChR2，膜片钳电生理记录GiV神经元，通过单细胞RT-PCR验证记录神经元的细胞类型（图4B-C）。他们发现，vlPAG NTS神经元对GiV GABA能而非谷氨酸能神经元产生兴奋性投射（图4C-E）。

接着，作者探究vlPAG NTS是否投射到脑区内部的GABA能神经元，因为vlPAG GABA神经元同样促进NREM睡眠[3]。他们使用相同AAV注射方法，膜片钳电生理记录vlPAG神经元，通过单细胞RT-PCR验证记录神经元的细胞类型（图4F-G）。他们发现，vlPAG NTS到脑区内部GABA能、谷氨酸能神经元均产生兴奋性投射（图4G-J）。

图4 vlPAG NTS神经元到GiV的功能性投射

4

GiV GABA神经元促进NREM睡眠

上文已知，vlPAG NTS神经元主要投射到GiV GABA神经元，那么GiV GABA神经元是否同样促进NREM睡眠呢？作者再次使用上文的神经元操控方法，在GAD2-Cre小鼠的GiV中注射AAV-DIO-ChR2或AAV-DIO-iC++并植入光纤（图5A），发现光激活GiV GABA神经元增加小鼠NREM睡眠时间，减少REM睡眠与觉醒时间；而光抑制GiV GABA神经元增加小鼠觉醒时间，减少NREM与REM睡眠时间（图5B）。他们又进行了化学遗传学操控实验，得到相似结果（图5C-D），表明GiV GABA神经元为调控NREM睡眠状态的重要神经元。

图5 GiV GABA神经元促进NREM睡眠

5

GiV GABA神经元支配多种单胺能神经元

在原则上，GABA神经元可以抑制促进觉醒的神经元，进而促进睡眠。于是，接下来作者探究GiV GABA神经元的投射下游。他们在GAD2-Cre小鼠的GiV中注射AAV-DIO-ChR2-eYFP，发现蓝斑（LC）、背侧中缝核（DR）、腹侧被盖区（VTA）中均有大量eYFP阳性纤维（图6A-C），这三个脑区均为促进觉醒的重要脑区[11-13]。行为学方面，光激活GiV GABA神经元到这三个脑区的纤维末梢均显著延长小鼠NREM睡眠时间（图6A-C），表明这三条环路均参与GiV GABA神经元对NREM睡眠的促进作用。

最后，为探究GiV GABA神经元是否直接投射到这三个脑区中促进觉醒的神经元，作者使用狂犬病毒逆行示踪方法，发现GiV 中含有大量LC去甲肾上腺素能、DR多巴胺能、VTA多巴胺能神经元的上游神经元，其中大多数上游神经元为GABA能神经元（图6D-F）。

综上，GiV GABA神经元对多脑区促进觉醒的神经元产生抑制性投射，进而促进机体进入NREM睡眠状态。

图6 GiV GABA神经元通过多条环路促进NREM睡眠

总结

睡眠是人们赖以生存的必备生理需求，中枢神经系统中负责调节睡眠-觉醒节律神经环路错综复杂，难以简单解析。过去研究表明，vlPAG GABA神经元抑制REM睡眠，但对于vlPAG谷氨酸能神经元是否同样参与睡眠-觉醒节律的调控过程，我们未能知晓。本篇文章结合光遗传学、化学遗传学、内窥镜钙成像、神经元示踪、电生理等技术发现vlPAG NTS神经元参与睡眠-觉醒节律调控，这群神经元在NREM睡眠过程中活性显著升高，激活它们促进NREM睡眠，抑制它们促进觉醒。这群vlPAG NTS神经元通过投射到GiV GABA能神经元以抑制LC、DR、VTA中促进觉醒的神经元，进而抑制觉醒过程。这项研究揭示了促进NREM睡眠的新神经环路，为临床治疗失眠症等相关疾病提供有力支持！ 

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参考文献

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